onsdag, september 18, 2019

Molekylære motorer danner spiraltrapp


Evolution news; 29. august 2019
Oversatt herfra.

Molekylære motorer henger sammen i en spiraltrapp


Bilde 1. Spiraltrapp (biologi) kredit: Jude Beck via Unsplash.


La oss bli kjent med en annen ikke-reduserbar kompleks molekylær motor. Denne er en mester i å brette ut proteiner, til og med de tøffe tilfellene som er vanskelige å håndtere. Metoden er genial.
En burde ikke tro at ikoner for intelligent design i biokjemi er begrenset til noen få favoritter, som bakterieflagellen, kinesin og ATP-syntase. Det er tusenvis av dem – titusenvis! Hver og én er fascinerende på sin måte. Dagens fokus er på en, kalt ‘Cdc48 ATPase-komplekset’, eller for korthets skyld Cdc48. Det er en annen ATPase (som betyr at den bruker ATP til energi) med en viktig jobb: å brette ut proteiner. De fleste proteiner, vil du huske, er foldet i 3D-former. Noen av dem kan bli ganske tettpakket , holdt sammen av elektriske ladninger og mekaniske krefter. Alle som har prøvd å løsne tråder, tau eller fiskesener vet at jo strammere knute, desto vanskeligere er den å løsne. Slik gjør Cdc48 jobben sin – med finesse.


Allesteds, som i allestedsnærværende
Før vi kommer inn på mekanikken til Cdc48, ville det hjelpe å lære om et annet protein som heter ubiquitin . Som navnet tilsier, er det allestedsnærværende (ubiquitous) i cellen. Fordi ubiquitin enkelt festes til mange domener på andre proteiner, ‘tagges’ de ofte slik at de blir lagt merke til av andre enzymer. Ubiquitins kan enkelt lenkes sammen, og overføre flere taggede-meldinger. Noen poly-ubiquitin-tagger forteller proteosomet (cellens søppeltømming) at substratet må gjenvinnes. Proteosomet fjerner poly-ubiquitin-taggen før den fyller det brukte eller ødelagte proteinet i den tønneformede skive-kutteren, hvor dens aminosyrer skilles ut for gjenvinning.
En annen poly-ubiquitin-tag informerer Cdc48 om at ‘dette substratet trenger å brettes ut.’ En slik situasjon kan oppstå når et protein er for tett pakket sammen for proteasomet, når det er en del av et multiprotein-kompleks, eller når det er i et område med vanskelig tilgang, for eksempel innebygd i en membran. Hva som skjer når proteinet fester seg til enzymet er ganske fantastisk. Handlingen ble nylig dechiffrert mer detaljert enn noen gang av Edward Twomey et al. som beskriver funnene sine i Science –her. Gjør deg klar for en tur ned i en spiraltrapp inne i en annen molekylær maskin!

Bilde 2. CdC48 -ATP som folder ut protein


Visualiser dens form
For å visualisere formen, tenk på to sekskantede dekk stablet oppå hverandre. En hånd fra innsiden tar tak i slutten av det første ubiquitinet, og trekker i det. Ut av bunn-dekket kommer et utbrettet protein. Presto! Hva skjedde på innsiden?

–Cdc48 / p97 tilhører familien AAA + (ATPases assosiert med forskjellige cellulære aktiviteter). Det inneholder et N-terminalt domene og to tandem ATPase-domener (D1 og D2). Seks monomerer danner en dobbelt ringstruktur, med en sentral pore. Cdc48 samarbeider ofte med den heterodimere kofaktoren Ufd1 / Npl4. Substrater bindes først gjennom den festede poly-ubikvitinkjeden til Ufd1 / Npl4 og beveger seg deretter gjennom porene til ATPase-ringene og blir dermed brettet ut. Denne translokasjonsprosessen krever adenosin 5′-trifosfat ( ATP ) hydrolyse av D2-domenene og involverer deres pore loop-rester. 
Kort fortalt trekker Cdc48 bokstavelig talt sitt substrat gjennom en sentral pore med makt. Poren, sier de, er formet som en spiraltrapp. Finplasserte aminosyrer som ser ut som løkker i porene, griper tak i substratet og trekker den gjennom på en ‘hånd-over-hand’ måte. Det er en kraftfull tråd-firgjører!
Hvor kommer ubikvitinet inn? Maskinen tar tak i poly-ubiquitin-merket først, og drar den inn i et spesiell spor i maskinen. Dette gir Cdc48 både et signal til å fortsette, og også noe å ta tak i for å gjenkjenne substratet som kommer inn etterpå.


En fantastisk motor
Twomey et al. ønsket å vite mer om denne fantastiske motoren.
–Mekanismen for substrat behandling ved Cdc48 er dårlig forstått. For eksempel er det ukjent hvordan Cdc48 kan takle et bredt spekter av til og med godt foldede substrater , det eneste kravet er en festet polyubikvitin-kjede . Spesifikt forblir det uklart hvordan et segment av et foldet substrat kan passere gjennom D1-ringen for å komme i kontakt med D2-poreløyfene som driver translokasjonen. Hvordan disse D2-underenhetene deretter translokerer substratet, er heller ikke kjent. Strukturer av beslektede heksameriske ATPaser indikerer et spiraltrapp-arrangement av poreløkker rundt substratet, men strukturer av Cdc48 ATPase som er knyttet til et poly-ubikitinert substrat, er ennå ikke bestemt.
Biokjemikerne fant en måte å saktne handlingen slik at de kunne se den. For å gjøre dette, måtte de mutere enzymet slik at det ikke fungerte så raskt. Deretter fanget de ‘filmrammer’ ved hjelp av kryo-elektronmikroskopi. Da kunne de sette rammene sammen og se hva som foregikk.

Bilde 3. CDC 48 proteosomet nedbrytes


–Strukturene viser to foldede ubiquitinmolekyler bundet til Npl4 lokalisert på toppen av Cdc48s D1-ring. Hydrogen-deuterium utvekslingsforsøk indikerer ytterligere ubiquitin-bindende steder på Ufd1. Overraskende nok blir ett ubiquitinmolekyl foldet ut og bundet til et spor av Npl4, som inneholder konserverte aminosyrer som kreves for substrat-utfolding. Utfolding av ubiquitin er bemerkelsesverdig, gitt at det er et ekstremt stabilt protein som kan overleve å koke. Det utbredte ubikvitin-molekylet projiserer sitt N-terminale segment gjennom D1 ATPase-ringen og griper inn poreløkkene til D2 ATPasene. Disse poreløkkene danner en trapp som fungerer som et ‘transportbånd’ for å bevege polypeptidet gjennom den sentrale poren.
Illustrasjoner i artikkelen viser ubiquitinene som passer godt sammen i en spesiell rille laget for å bestille dem. Maskinen bretter ut det første ubiquitinet (som de sier, ganske en prestasjon for et stabilt protein som kan overleve å koke!). Dette gir substratet som følger et ‘håndtak’ som maskinen kan trekke i. Ubikvitinene griper inn i den spesialiserte rillen i D1, men også ‘transportbåndet’ i D2, der en spiraltrapp av seks løkker som heter A til F, trekker på substratet og bretter det ut på en hånd-over-hånd måte. Sekvensen av peptider som kommer inn spiller ingen rolle for denne generelle utbrettings-maskinen; den kan takle dem alle. Spesielt tøffe nøtter kan kreve ytterligere ubiquitin ‘leder’ kjeder:
–Resultatene våre forklarer hvorfor Cdc48 ATPase kan virke på et bredt spekter av til og med godt brettede proteiner: Den bruker ubiquitinbinding og utbretting for å starte substrat-behandling. Cdc48 trekker først N-enden til det utfoldede ubiquitinmolekylet. Strukturen innebærer at hvis substratet er direkte festet til det utfoldede ubiquitinet, vil det deretter translokalisere gjennom den sentrale poren; Ellers må Cdc48 suksessivt utfolde de mellomliggende ubiquitin-molekylene til den når og bretter ut substratet.


Hvorfor maskinen er viktig
Denne maskinen er viktig. Defekter i Cdc48 kan forårsake nevrologiske sykdommer. Dette må vel være et kron-produkt fra sen evolusjon, ikke sant? Nei; forskerne gjorde sitt arbeid med gjær, en av de aller enkleste eukaryotene. Og det finnes også i arkea, av noen ansett for å være de mest primitive livsformene på jorden. Man kunne med rette mistenke at uten de generelle ‘frigjørerne’ (untanglers) som var til stede i begynnelsen, ville de første cellene raskt bli tilstoppet av de sammenfiltrede flokene med ubrukelige polypeptider. 
Trenger du mer forundring? Forskerne fant ut at denne maskinen har bevegelige deler. Hvis du husker de gamle håndstyrte etikett-produsentene, er det litt sånn: brukeren ville dreie et håndtak for å sende båndet i bevegelse med hver bokstav. Her er hva forskerne fant:
–D1- og D2-domenene oppfører seg begge som stive legemer (fig. s. 11). Superposisjon av Cdc48-monomerer på basis av D1-domenene viser at trappearrangementet til D2-domenene er forårsaket av stive kroppsbevegelser i forhold til D1 (fig. s. 11B). Vinkelen mellom D1- og D2-underenhetene endres dramatisk fra underenhetene B til E, noe som forårsaker en forskyvning av D2-poresløyfen med mer enn 18 å (fig. s. 11B).
Det er en ganske stor bevegelse for et molekyl. Slik håndterer den generelle utbrettings-maskinen enhver kjede:
–Fem av underenhetene (A til E) tar kontakt med polypeptidet og danner en tydelig trapp , med underenhet A på toppen og underenhet E på bunnen … Alle subtratenheter som er engasjert i substratet, kontakter polypeptidet gjennom Trp561 og Tyr562-restene i poreløkkene deres (fig. 6B). Disse restene ‘klemmer’ annenhver peptidbinding i det utvidede polypeptid-substratet. Dermed beveger hvert kraftslag i den heksameriske ATPase to aminosyrer i substratet , og interkalering –her av poreløkker mellom sidekjeder tillater translokasjon av et polypeptid uavhengig av dets spesifikke aminosyresekvens.

Bilde 4. ATPase97-degradering gjennomrekning


Hvor du skal ta tak
Med andre ord, uavhengig av formene eller størrelsene på aminosyrene, vet maskinen hvor den skal gripe. Den ‘føler’ etter peptidbindingen som er felles for alle aminosyrerester, klemmer den og trekker med et ‘kraftslag’, noe som resulterer i en stor bevegelse mellom D1 og D2. Under-enhetssløyfene er i kontakt med substratet hele veien, og sørg for at det folder seg ut riktig. Men hvorfor flytter ikke trekk-bevegelsen maskinen også? Deri ligger et annet under. Tenk på et transportbånd. Beltet beveger seg etter hvert tilbake til startposisjonen. 
–Sammen avslører våre strukturer at D2 ATPases bruker en ‘transportbånd’ -mekanisme for å translokere en polypeptidkjede gjennom den sentrale poren (fig. 6D). I denne modellen binder underenhet A seg til toppen av polypeptidkjeden når den konverteres fra ADP-bundet eller nukleotidfri tilstand til ATP-bundet tilstand. Underenhetene beveger seg deretter nedover, og drar polypeptidkjeden med seg. I den laveste substrat-engasjerte posisjon, hydrolyserer underenhet E -ATP. Deretter, i ADP-bundet eller nukleotidfri tilstand, kobles underenhet F fra substratet slik at det kan bevege seg til topposisjonen og starte en ny syklus.


Dette er så likt makromaskiner vi er kjent med: transportbånd, vindmøller, symaskiner og andre enheter som kontinuerlig replasserer seg for kontinuerlig handling. Andre molekylære maskiner bruker en lignende transportbånd-mekanisme, sier forfatterne, men Cdc48 ser ut til å være deluxe-modellen med en ekstra kontakt som ‘kan tillate Cdc48 (p97) å utøve mer kraft for å folde ut sine substrater’. Dette er ikke enkel kjemi . Dette er maskiner med bevegelige deler, krefter og samhandlende underenheter!
Som forventet er mekanismen enda mer komplisert enn beskrevet her. Og igjen, som forventet, har forfatterne ingenting å si om evolusjon.

Ville de våge?
Behe bemerker i Appendikset til Darwin Devolves at evolusjonister ikke har klart å forklare bakterie-flagellen eller blodkoagulerings-kaskaden med en darwinistisk mekanisme. Han ga dem den utfordringen for darwinismen i Darwins Black Box for tjue år siden. Et par team prøvde det, men unngikk problemet. Resten har vært tause. Og likevel beholder de fortsatt jobbene sine, og krever ene-autoritet for darwinisme i vitenskapen. Det er på tide med litt ‘overkill’: ikke bare én eller to molekylære maskiner, men tusenvis av dem, inkludert Cdc48. Vis dem alle, dag etter dag, ustanselig, raskere og raskere, til den mest ivrige darwinist kaster inn håndkleet.

Til å begynne med, hvis du har sett den gamle I Love Lucy- episoden, kunne Lucy og Ethel takle transportbåndet med sjokolade –her. De kunne unnskylde en og annen manglende, eller svelge en annen. La oss plassere Jerry Coyne og Richard Dawkins på deres sted og se på moroa når vi sender molekylære maskiner nedover transportbåndet for å pakkes inn i darwinistiske forklaringer, og når de virkelig svetter, rop: «Få opp farten, alle sammen!»

Tager: AminosyrerATP-syntaseDarwin Devolvesmolekylær motorproteosomet;

Oversettelse og bilder ved Asbjørn E. Lund

Back To Top